NBRCニュース　第３９号

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                   　　　NBRCニュース No. 39（2016.6.1）
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　熊本地震により、被災された地域の皆様、関係者の皆様に心よりお見舞い申し上げま
す。いまだ余震や雨など心配な状況が続いておりますが、被災地の一刻も早い復興をお祈
りします。今号では、微生物系ラボでのマメ知識集になることを期待した新連載「バイテ
ク分析法」他、2本の連載をお届けします。お知らせもいくつか掲載しておりますので、
最後までお読みいただければ幸いです。

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　内容
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　１．新たにご利用可能となった微生物株
　２．あなたの活用例教えてください（2）
　　　食品・飲料の殺菌管理指標菌に何を選ぶか？
　　　微生物制御の指標菌そしてナノサーチ技術開発におけるNBRC株の利用
　３．微生物あれこれ（35）
　　　微生物から始める地域活性化　～釜石はまゆりプロジェクト～
　４．バイテク分析法（1）
　　　微生物ゲノム解析のためのDNA抽出の注意点
　　　～Brevibacillus brevis NBRC 100599での事例～
　５．生物遺伝資源バックアップサービスの内容を拡充しました
　６．NITEバイオテクノロジーセンター展示のお知らせ
　７．NITEフレンドシップデイ開催のお知らせ

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　１．新たにご利用可能となった微生物株
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◆ NBRC株
　酵母 3株、糸状菌 61株、細菌 63株、アーキア 5株が新たにご利用可能となりました。
　糸状菌には、アカマツ材の腐朽菌の研究で分離された、多彩な担子菌・子嚢菌類30株
（NBRC 110165～110194）が含まれます。
　細菌では、ヒアルロン酸分解酵素の阻害剤であるヒアルロマイシンの生産菌
Streptomyces hyaluromycini NBRC 110483、フェナントレン分解菌Burkholderia sp. NBR
C 110738と、この株のフェナントレン分解を助ける働きをするBurkholderia caribensis 
NBRC 110739が公開されました。

【詳細】　https://www.nite.go.jp/nbrc/cultures/nbrc/new_strain/new_dna.html

◆ RD株
　スクリーニング株（RD株）として、奄美大島の地衣類、朽木などから分離した放線菌・
細菌41株を追加いたしました。是非、リストをご覧ください。

【詳細】　https://www.nite.go.jp/nbrc/cultures/rd/new_rd.html
【RD株リスト】　https://www.nite.go.jp/nbrc/cultures/rd/available_rd_list.html

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　２．あなたの活用例教えてください（2）
　　　食品・飲料の殺菌管理指標菌に何を選ぶか？
　　　微生物制御の指標菌そしてナノサーチ技術開発におけるNBRC株の利用
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（ナノ・マイクロバイオ研究所　中西弘一、
　　　　　株式会社島津テクノリサーチ　小暮亮雅、摂南大学　桑名利津子、高松宏冶）
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1. はじめに
　食品・飲料の製造工程における微生物制御は、安全・安心確保のための必須技術であ
る。加熱温度や加熱時間などの加熱殺菌条件が制御のポイントとなってくる。微生物の耐
熱性の評価は、加熱温度と時間から、生残率が10分の1になるD値を求める方法が用いられ
ている。その評価には、まず対象の微生物を単離、培養し、さらに芽胞形成細菌の場合
は、芽胞形成条件を検討し芽胞を誘導させるといった、煩雑な作業が伴う。また、輸入の
増加に伴うなどで新規微生物は次々に現れ、調査にかけられる時間は少ない。我々は、こ
れらの問題を解決するために、ナノサーチ技術と称する走査型プローブ顕微鏡を用い、細
胞1個の細胞の物理的な評価により、微生物の耐熱性を迅速に計測する方法を開発した。

2．ナノサーチ技術とは
　我々のナノサーチ技術は、走査型プローブ顕微鏡（SPM：Scanning Probe Microscope）
を用いて、超微小レベルで生物細胞1個の様々な物理的評価を行う技術で、場合によって
は培養や芽胞調製などの作業をせずに、試料をそのまま評価に使うことができる。これま
でに、ヤング率による芽胞の硬さから芽胞の耐熱性を推定する方法や、線膨張率が急激に
変化する転移温度から加熱による死滅温度を求め、その転移温度から耐熱性を測定する方
法を提案している。現在、SPMの急速な進化により評価可能な物理的項目は更に増加して
いる。
　紙面の都合上、詳しい技術内容は、解説記事（文献1）に譲る。

3．殺菌管理指標菌について
　加熱殺菌を管理するための指標菌は｢殺菌管理指標菌」と呼ばれ、加熱殺菌条件の設定
の基準になる（文献2）。一般細菌や大腸菌群の衛生指標菌では、食品衛生法に定められ
た殺菌条件で充分殺滅できるため、実際に製品に品質危害を及ぼす、耐熱性の芽胞形成細
菌が殺菌管理指標菌となる。芽胞を形成する一連のグラム陽性の芽胞形成細菌は、熱、紫
外線そして化学殺菌剤などにも殺菌耐性を有するため、最も警戒する微生物である。危害
を及ぼす芽胞形成細菌は製品中の栄養成分の種類と濃度、包装形態による酸素の有無、食
品添加物として認可された増殖阻害剤の有無やその濃度によって種類が異なる。そのため
製品の種類や製造環境（製品カテゴリー）により、危害となる細菌の種類に応じた加熱殺
菌条件を決める必要がある。芽胞形成細菌が製品中で増殖できるかどうかの重要な要因
は、製品カテゴリーによって異なり、殺菌管理指標菌も異なってくるのである。

4. 殺菌管理指標菌として使用する株
　多くの研究室では独自の株を殺菌管理指標菌としているが、NBRCなどの微生物保存機関
から誰でも入手可能な株を用いることによって、異なる研究室間で殺菌条件を統一して評
価したり、同一株のデータをレファレンスとして自分たちの指標菌の殺菌耐性と比較した
りすることが可能である。我々がこれまで芽胞形成細菌の指標菌として用いた株は、
Geobacillus stearothermophilus NBRC 13737、Bacillus coagulans DSM 1 (NBRC 12583)
Bacillus subtilis subsp. subtilis NBRC 13719、Bacillus megaterium NBRC 15308、
Bacillus licheniformis NBRC 12200、Thermoanaerobacter mathranii DSM 11426及び
Moorella thermoacetica DSM 521などである。
　我々のナノサーチ技術の開発では、取得した芽胞の殺菌条件データを広く応用するため
に、NRBCをはじめとした微生物保存機関から入手した、同一菌株を用いることが重要だと
考えている。微生物保存機関の株を利用することで、この微生物制御分野の技術の発展と
情報の共通化につながっていくだろう。

【文献】
  (1) 中西弘一、小暮亮雅、桑名利津子、高松宏治 (2016) ナノサーチ技術の開発
      ―走査型プローブ顕微鏡による新しい微生物の迅速耐熱性評価法、防菌防黴学会
      誌、44:125-129.
　(2) 中西弘一 (2015) 講座「微生物制御に係わる基礎的な背景と最新の話題」清涼飲料
      分野における微生物制御、防菌防黴学会誌、43:81-86.

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　３．微生物あれこれ（35）
　　　微生物から始める地域活性化　～釜石はまゆりプロジェクト～　　　（高橋幹男）
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　2011年3月11日の東日本大震災の被災地のひとつ、岩手県釜石市。市の花「はまゆり」
は、リアス海岸の崖の上によく咲いており、商店街やマラソン大会、電車の名前にも使わ
れているほど、地元の方々から愛されている花です。釜石市佐須地区の漁港の岩肌には群
生地があり、そこは大津波で完全に水没しながらもその年の夏にはたくさんの花を咲か
せ、その花に励まされながら復旧に取り組んだという、まさに地元の人々のシンボルであ
り心のよりどころである「はまゆり」。
　「はまゆりから酵母を採取して、釜石にしかない商品開発をしたい」という野田武則釜
石市長から依頼を受けた北里大学感染制御研究機構釜石研究所（当時）（以下、釜石研）
とNBRCは共同で「釜石はまゆりプロジェクト」を開始しました。しかし、「はまゆり」は
震災後の心の支えとなっている花であるため採取して良いのは10輪だけでした。花が咲い
ている時期が短いことから、事前の下見もなくぶっつけ本番の1回限りという、国内外の
様々な環境から微生物の探索、分離、同定を行ってきた我々NBRCにとっても非常にチャレ
ンジングな取り組みでした。
　採取当日は釜石市、釜石・大槌地域産業育成センター、地元企業、町内会の方々にもご
協力をいただきながら、真っ黒な岩肌に咲く華麗なオレンジ色の「はまゆり」を、大切に
大切に採取しました。雨で濡れた地面に足を滑らせ転倒し、額に軽いケガをした職員もい
ましたが、手に持った「はまゆり」は離しませんでした。

　　　　　　　　左：はまゆりの花　　右：はまゆりの採取の様子

　約1カ月後、「Saccharomyces cerevisiaeが採取できた！」と実験室からの叫び声。釜
石研からも採取できたとの連絡があり、まずは第1関門クリアと関係者一同、胸をなで下
ろしました。採取された酵母は釜石研においてさまざまな試験が行なわれ、地元の関係者
の多大な努力と情熱が実を結び、この酵母を利用したハンバーガー、海鮮中華まん、クラ
フトビール等が開発され、既に販売されています。この「釜石はまゆり酵母」は
Saccharomyces cerevisiae KS6株 (= NBRC 112000)として、NBRCから入手可能です。
　「釜石はまゆりプロジェクト」の取組みは、国の「まち・ひと・しごと創生総合戦略に
基づく、「地域住民生活等緊急支援のための交付金（地方創生先行型）」の参考事例集に
も掲載され、他の地域からも注目されています。NBRCはこれまで蓄積してきた微生物に関
する技術や知見を活かし、地方自治体、公設試験研究機関や大学など、産学官連携による
地域ブランド商品の創出を推進していきます。

【参考】
北里大学感染制御研究機構釜石研究所が地場の酵母を利用して復興支援 --「釜石はまゆ
りプロジェクト」
https://www.u-presscenter.jp/2016/02/post-35082.html

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　４．バイテク分析法（1）
　　　微生物ゲノム解析のためのDNA抽出の注意点
　　　～Brevibacillus brevis NBRC 100599での事例～ 　　　　　　　　 （細山　哲）
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　次世代シーケンサーが市場に登場してから約十年が経過し、以前に比べ、全ゲノムシー
ケンス解析は早く・安く・簡便に実施できるようになりました。受託解析サービスも比較
的安価で利用できることから、微生物のゲノム解析を検討されている方も多いと思いま
す。NBRCでは、これまでに500株以上のゲノム配列（ドラフト、完全長の配列）を解読し
ています。今回は、我々が過去に苦労した事例をもとに、ゲノム解析に用いるDNAを微生
物から抽出する際の注意点について紹介します。
　ゲノム解析を実施する際は、予想されるゲノムサイズに対し、キャピラリーシーケン
サーを用いたサンガー法で6倍以上、ショートリードタイプの次世代シーケンサーを用い
た解析で50倍以上の冗長度（ゲノム上のある領域におけるリードの重なり）に相当する
シーケンス量が必要だといわれています。ゲノム配列全体に対して、リード（シーケン
サーから得られる塩基配列断片）を均一に取得することが望ましいですが、実際の解析で
は、取得したリードがゲノムの特定の領域に偏ることがあります。Brevibacillus brevis
NBRC 100599の場合(1)、当時のサンガー法により解析を実施したところ、得られたリード
に極端な偏りが見られ、データ量として十分な冗長度（16倍）を出力していても、完全長
の配列に繋げられませんでした。そこで、プライマーウォーキングなどの実験を行い、最
終的に6.3 Mbの完全長ゲノム配列を完成させました。その後計算したところ、複製開始点
付近から複製終結点付近にかけて冗長度が徐々に低くなり、終結点付近は他の領域に比べ
て2～3倍低いことが確認されました。

　　　　　　　　　　　　　　　冗長度の偏りの概念図

　この原因として、NBRC 100599の倍加時間がDNAの複製時間よりも速いことが考えられま
した。ゲノムサイズが4.6 Mbの大腸菌におけるDNA複製時間は約40分であることから(2)、
大腸菌と同様であると仮定すると、ゲノムサイズが6.3 MbのNBRC 100599では約55分と推
定されます。そしてNBRC 100599の対数増殖期における倍加時間は20～30分でした。した
がって、この時のDNAの複製時間よりも倍加時間が約2～3倍速く、細胞分裂にDNA複製が追
いつかないため、複製が完全に終了していないDNAを持つ細胞が多いことが予想されまし
た。我々がゲノム解析に使用したDNAは、対数増殖期の菌体から得られたものでしたの
で、上述のシーケンス配列の偏りは、複製開始点から“中途半端”に複製されたDNAを持
つ細胞から抽出したDNAを使用したために生じたと推測されます。
 本株のように倍加速度の速い微生物から抽出したDNAを全ゲノム解析に用いると、リード
の偏りが生じる可能性があります。増殖曲線で定常期の細胞を用いる、または貧栄養な培
地等を用いて生育速度を遅らせるなどの工夫をしてDNA抽出を行うことが、均質なシーケ
ンスデータの取得に有効だと思います。

【文献】
（1）http://www.bio.nite.go.jp/dogan/project/view/BBR
（2）Cooper S., et al. (1968). Chromosome replication and the division cycle of 
     Escherichia coli Br. J Mol Biol. 31:519-540.

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　５．生物遺伝資源バックアップサービスの内容を拡充しました
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　震災等の災害、停電や保存設備の故障等から皆様の貴重な微生物を守るための「生物遺
伝資源バックアップサービス」の内容を拡充しました。液体窒素タンク気相での保管、フ
リーザーや液体窒素タンク一台を専有できるサービスなどを新たに加えております。お預
けいただける生物遺伝資源の種類も増えました。詳細は以下のページをご覧ください。

【詳細】 https://www.nite.go.jp/nbrc/cultures/backup/backup.html

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　６．NITEバイオテクノロジーセンター展示のお知らせ
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　以下に出展いたします。ブースではお立ち寄りいただいた皆様からのご相談やご質問に
もお答えします。是非お越しください。ご来場には入場券が必要となりますので、事前に
ご連絡ください。

第29回インターフェックス　ジャパン
　日時：平成28年6月29日（水）-7月1日（金）10:00-18:00
　場所：東京ビッグサイト　東１ホール　ブース番号：24-37
　参加費：無料　（事前予約必要）
　　 　　http://www.interphex.jp/
　MALDI-TOF/MSを用いた微生物迅速同定法開発、ゲノム情報を活用した微生物機能の
　探索・評価、微生物のバックアップなど、最近の取り組みについてご紹介します。

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　７．NITEフレンドシップデイ開催のお知らせ
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　NITEの日頃の活動を皆様に知っていただくために、今年もフレンドシップデイを7
月30日に開催します。身近な物を使った体験型の実験や大人向けの講演など、子どもから
大人までみんなが楽しめるイベントを用意しています。夏休みの自由研究にも役立つかも
しれません。皆様のお越しをお待ちしています。

　日程：平成28年7月30日（土）10:00～16:00
　場所：独立行政法人製品評価技術基盤機構
　　　　東京都渋谷区西原2-49-10
　詳細：https://www.nite.go.jp/koho/event/friendship/2016.html

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　編集後記
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　サルミアッキというフィンランドの飴はご存じでしょうか？塩化アンモニウムを使って
いて、世界一マズい飴として有名だそうです。ひょんなことからこの飴を食べてみました
が、食感はグミのような感じで、甘くて・辛くて・苦くて・えぐみのある不思議な味でし
た。私は、スコットランドのアイラ島で作られたピートが香るウイスキーが大好きなの
で、このサルミアッキもアリでした。チョロギに続き、知らない食べ物第2弾は以上で
した。(HS)

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　・画像付きのバックナンバーを以下のサイトに掲載しております。受信アドレス変更、
　　受信停止も以下のサイトからお手続きいただけます。
　　https://www.nite.go.jp/nbrc/cultures/others/nbrcnews/nbrcnews.html
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　　万が一間違えて配信されておりましたら、お手数ですが、下記のアドレスにご連絡く
　　ださい。
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　　スにご連絡ください。
　・掲載内容は予告なく変更することがございます。掲載内容を許可なく複製・転載され
　　ることを禁止します。
　・偶数月の1日（休日の場合はその前後）に配信します。第40号は2016年8月1日に配
　　信予定です。

　　編集・発行
　　　　独立行政法人製品評価技術基盤機構（NITE）バイオテクノロジーセンター
　　　　NBRCニュース編集局（[email protected]）
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