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NBRCニュース No. 22（2013.8.1）
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NBRCニュース第22号をお届けします。今号は微生物あれこれ、微生物の培養
法、特許微生物寄託のイロハの3つの連載と、バイオエタノールと微生物の第3
回をお届けします。最後までお読みいただければ幸いです。
（等幅フォントでご覧ください）
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内容
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１．新たにご利用可能となった微生物株（2013年5月21日～7月22日）
２．微生物あれこれ（19）
水辺の芸術家、実は策略家 半水生菌
３．微生物の培養法（11)
アンモニア酸化細菌の復元と亜硝酸比色法による増殖の確認
４．特許微生物寄託のイロハ (3)
特許寄託ってどうやるの？
５．バイオエタノールと微生物 (3)
６．お盆期間中のNBRC微生物株・DNAリソースの発送休止に関するお知らせ
７．NITEフレンドシップデイの開催のお知らせ
８．NITEバイオテクノロジーセンター展示のお知らせ
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１．新たにご利用可能となった微生物株（2013年5月21日～7月22日）
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酵母 1株、糸状菌 27株、細菌 72株、アーキア 1株、微生物ゲノムDNA 1種
類を新たに公開しました。
【新規公開株一覧】
https://www.nite.go.jp/nbrc/cultures/nbrc/new_strain/new_dna.html
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２．微生物あれこれ（19）
水辺の芸術家、実は策略家 半水生菌 （山口 薫）
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ペロペロキャンディー、樽、イクラ、毛糸、クリスマスツリー、蝶、シャン
デリアなどなど。このような非常にユニークな形をした胞子を作る、半水生菌
と呼ばれるカビがいます。半水生菌は、水辺で水に浸った腐朽木や枯葉の上に
生息します。普段は菌糸で生育していますが、水量の変化により、これらの材
が空気中に露出した時に水に浮く胞子を作ります。水中でも生育できますが、
胞子形成を水中ではなく湿度が高い空気中で行う点が、水に浮く胞子を水中で
作る水生菌とは区別され、「半」水生菌と呼ばれています。さきほどの胞子の
多様な形は、中に空気を抱き込んだり、プレート状で浮力をもたせたり、アメ
ンボのように点でバランスをとったりと、すべて水に浮くためのものです。水
に浮いた胞子は、水の流れに乗って遠くへ分散され、別の腐朽木や枯葉にひっ
かかり、そこで菌糸を伸ばして定着し、新しい生活の場を手に入れます。川な
どで水に浮く泡をみかけることがありますが、それをひしゃくですくって口の
広い瓶やボトルに入れて持って帰り、顕微鏡で観察すると、泡にトラップされ
た半水生菌や水生菌の胞子を見ることができます。
半水生菌の胞子画像 半水生菌はとても美しい胞子を作る芸術家ですが、自然環境で生き残るため に、水に浮く胞子を形成して生息域を広げる戦略により、水辺での居場所を手 に入れたなかなかの策略家でもあります。実際に、系統進化の研究で、陸生菌 を起源にもつ半水生菌が見つかっており、その種は陸から水辺に降りてきて、 その際に水辺での生活に適応して水に浮く胞子を作るように形態を進化させた と考えられます。 半水生菌は水辺の腐朽木などで生育することから、これらの分解に関与して いることがわかっており、セルロースやリグノセルロース分解能が報告されて います。また、水生菌が重金属や化学物質に汚染された水環境の浄化の一端を 担っているという報告があることから、同様の環境で生育している半水生菌も そういった性質があるのではないかと筆者は期待しています。 これまで、日本各地やタイから多種多様な半水生菌を分離して、NBRCに保存 し、公開してきました。深夜12時を過ぎて、もうそろそろ帰らなければと思っ ているさなか、見たこともない不思議な形をした胞子を見つけてしまうと、時 間を忘れて夢中で分離し、観察してしまいます。半水生菌は、過酷な自然環境 で生き残るために魅力的な胞子を作り、人を引きつけ、NBRCというカルチャー コレクションでおいしい培地をエサとしてもらいながら生き残る新たな戦略を 近年ではとっているようです。
半水生菌の胞子画像 【詳細】 https://www.nite.go.jp/nbrc/cultures/nbrc/use/thaiaafungi.html ====================================================================== ３．微生物の培養法（11) アンモニア酸化細菌の復元と亜硝酸比色法による増殖の確認 （内野佳仁） ====================================================================== Nitrosomonasなどのアンモニア酸化細菌（ammonia oxidizing bacteria、 AOB）は、アンモニアを亜硝酸に酸化することでエネルギーを獲得する好気性 の独立栄養細菌です。亜硝酸酸化細菌とともに硝化菌と呼ばれ、生態系の窒素 循環において重要な役割を果たしています。生活・産業廃水から窒素化合物を 除去する廃水処理には硝化菌の働きが利用されており、AOBは我々の生活に欠 くことのできない有用な微生物です。 AOBは増殖しても培養液があまり濁らないため、肉眼では増殖したことが分 かりにくく、ユーザーの皆様から増殖の確認方法についてよくお問い合わせを いただいております。増殖確認方法の一例として、AOBの増殖にともない生成 される亜硝酸を比色定量する方法があります。亜硝酸の比色法としてはいくつ かの方法が存在し、様々な亜硝酸測定キットが市販されていますが、ジアゾ・ カップリング反応で生じさせたアゾ色素の特定波長で吸光度測定を行うという 測定原理は共通しています。AOBの増殖確認に適用するためのポイントは、下 記の2つです。 1. 各方法における亜硝酸の測定濃度範囲を確認すること 2. それに合わせて培養液を希釈すること 培養液の希釈倍率は100倍が目安です。亜硝酸比色法によるAOBの増殖確認方 法の例を下記に示します。 ◆用意するもの 第1液：スルファニル酸8 gを5N 酢酸 1 Lに溶かします。 第2液：α-ナフチルアミン5 gを5N 酢酸 1 Lに溶かします。 ◆L-乾燥標品の復元と培養液に含まれる亜硝酸の比色定量の手順 (1) 0.1-0.2 ml程度の培地をアンプルに入れて細胞を懸濁し、それを5-10 ml の液体培地（No. 829培地）が入った試験管に入れて、30℃で静置培養し ます。 (2) AOBの培養中、経時的に培養液を50μlずつとります。培養期間の目安は2 週間です。培養液の採取は、培養開始時から始め１日おきに行います。増 殖活性の有無を確認するだけなら、培養開始時から1週間おきでかまいま せん。 (3) (2)の培養液50μlに蒸留水を加え、5 mlに定容します（100倍希釈）。 (4) 第1液 1 mlを(3)に加えてよく混合し、5分間静置します。 (5) 第2液 1 mlを(4)に加えてよく混合し、20分間、室温（暗所）で静置しま す。アンモニア酸化細菌が増殖していると亜硝酸が生成されているため、 ピンク色に発色します。 (6) 分光光度計を用いて波長540 nmの吸光度を測定し、検量線から亜硝酸の濃 度を求めます。 ◆検量線の作成 5 mlの亜硝酸イオン標準溶液を0-1 mg/Lの濃度範囲で段階的に作製し、上記 (4)～(6)の手順で発色させて吸光度測定します。NBRCでは、1.5 mg/Lの亜硝酸 ナトリウム水溶液を1 mg/Lの亜硝酸イオン溶液としています。蒸留水で希釈し 亜硝酸イオン濃度が0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/L の6種類の亜硝酸イオン 溶液を用意して検量線を作成しています。 AOBの増殖は継時的な亜硝酸濃度の上昇により確認できます。
亜硝酸比色法 【培養培地】 No. 829培地 ====================================================================== ４．特許微生物寄託のイロハ (3) 特許寄託ってどうやるの？ （村松由貴） ====================================================================== 今回は特許微生物をご寄託いただく手順・手続きについてご紹介します。寄 託手順の概要は、次のようになります。 (1) 寄託申請書を作成する。 (2) 寄託申請書と微生物を特許微生物寄託センター（NPMD）あるいは特許生物 寄託センター（NITE-IPOD）（以下まとめて、NITE特許センター）へ送付 する。 (3) NITE特許センターから受領書が送られてくる。 (4) NITE特許センターで生存確認試験が終了すると、手数料の請求書が送られ てくる。 (5) 入金後、受託証が送られてくる。 以下、各項目について詳しく説明いたします。
特許微生物寄託手続きのフロー (1) 細菌等、動物細胞、受精卵はNPMDで、植物細胞、種子、藻類、原生動物は NITE-IPODで受付けています。NPMDとNITE-IPOD、国内寄託と国際寄託では、申 請書・承諾書の様式や内容が異なりますので、それぞれの申請書をご利用くだ さい。形式が似ていて区別するのは難しいのですが、申請書の左上に【NPMD】 または【IPOD】のロゴ、【国際】もしくは【国内】と記載されています。寄託 申請書の記入については、メール等で事前確認も承っています。海外原産の微 生物の場合、植物防疫所の許可を得て輸入された菌株もあると思います。それ らを寄託される場合は、NITE特許センターへ微生物を移動する許可を植物防疫 所からいただく必要がありますので、微生物送付前に必ずご連絡ください。 (2) 寄託される標品の数量は、細菌等の場合は10本以上、受精卵・動物細胞の 場合は12本以上必要です。微生物と書類の両方が揃ってから、受領の手続きが 開始されます。 (3)～(5) NITE特許センターからお送りする受領書には、例えば「NITE AP- xxxx」等の受領番号が記載されています。「AP-xxxx」についている最初の「 A」は仮の番号の意味で、その後の生存確認試験結果が問題なければ、請求書 をお送りします。入金が確認でき次第、受託証を発送します。「A」を除いた 「NITE P-xxxx」が受託番号となります。ただし、受託証が発行されるまでは 受領番号が失効する可能性もありますので、受託証発行後に特許出願されるこ とをお薦めします。生存確認試験を行うため、受託証発行までに要する時間は 微生物の培養期間によるところが大きいです。できるだけ時間的余裕を持って ご寄託ください。生存確認試験の具体的な内容については、次号でご紹介しま す。 詳細は、特許微生物寄託・分譲のガイドにも記載していますので、ご参照く ださい。 【特許微生物寄託・分譲のガイド】(クリックするとPDFファイルが開きます) NPMD 【PDF：3,969KB】 NITE-IPOD【PDF：3,805KB】 ====================================================================== ５．バイオエタノールと微生物 (3) （紙野 圭） ====================================================================== 今回は数年前に新しく見いだされて少し話題になっている一群のバイオマス 分解酵素についてです。その見いだされる経緯が少しおもしろいのでご紹介し ようと思います。それはLPMO（Lytic Polysaccharide Monooxigenases）と名 付けられた糖質分解酵素の新しいファミリーです。糖質分解に関わる酵素の種 類は非常に多く、CAZyというホームページにその情報が整理されています。管 理するフランスの研究グループが手作業で情報を整理している信用あるサイト ですが、このファミリーの発見をきっかけに3つに分けられていたカテゴリー が4つに増えることになりました。 実は、そのタンパク質そのものの存在はかなり以前より知られていたのです が、どのような活性を有するタンパク質なのか誰も知りませんでした。セルラ ーゼの研究者達は、菌類によるセルロース分解の際に誘導されるこのタンパク 質を糖質加水分解酵素の1つのファミリー（Glycoside Hydrolases (GH) 61） としていましたが、この酵素単独では非常に弱いセルラーゼ活性しか示しませ んでした。やがて、この酵素を主要セルラーゼ群に足すとセルラーゼ活性が向 上することが研究者達の間でささやかれるようになります。ですが、データに バラツキがあってすっきりしませんでした。相次いでゲノム配列が決まる中、 この相同遺伝子はひとつの菌にいくつもみつかり、またそのタンパク質の結晶 構造までもが先に決まってしまいます。でも何をしているのかわからないので す。 その正体は思わぬきっかけから明らかになっていきます。キチンを分解する キチナーゼの研究です。セルロース同様、キチンも様々な生物が合成するいわ ゆるバイオマスです。いずれも結晶として（分子の形が単純なので、無数の分 子が同じ配向でパッキングして）存在するため、その分解が難しいことで知ら れています。バクテリアのキチナーゼ研究者の間でも不思議なタンパク質の存 在が知られていました。そのタンパク質はあたかもキチンにくっつくだけ（触 媒しない）のようなのでCarbohydrate Binding Module (CBM) 33に分類されて いました。ですが、結晶構造のキチンに結合する面には電荷を有するアミノ酸 が多く、通常のCBMとは“ちょっと違う”こと、GH61とCBM33は構造が似ている こと、また何かの金属がひとつ配位していることなどが指摘されるようになっ てきます。 ちなみに研究初期に目をつけてこのタンパク質の性状を初めて調べたのは新 潟大学のグループです。このタンパク質でもキチン分解を加速する効果に注目 が集まっていき、キチンの結晶を緩めるような活性をもっているのではないか と考えられるようになっていきます。ですが、“金属タンパク質である“とい う知見が重要なきっかけであったかもしれません。ある研究グループがこのタ ンパク質が酸化的に結晶性キチンを切ることをつきとめ、一挙に物事が解決へ と向かいます。GH61でもセルロース結晶を酸化的に切る活性が確認されます。 サンプル調製の際に金属イオンを抜かないように注意し、また電子供与体とな る分子を共存させることで活性も安定して検出できるようになります。また天 然の電子供与体にも目が向けられ、以前より良く知られていた異なる酵素（ Cellobiose dehydrogenase、CDH）、あるいはリグニン分解物がその役割を担 うということがわかってきています。つまりセルロースあるいはキチン結晶の 分解は、エンド型酵素－エキソ型酵素－オリゴマー分解酵素の相乗効果で進む というこれまでのモデルに加えて、新たな酸化的分解系が働いているのだとい うことがわかったのです。これを受けて、リグニンの酸化的分解酵素の一群も 合わせたAuxiliary Activities (AA)という新しいカテゴリーがCAZYに加えら れることになりました。 このGH61（改名されて現在はAA9）の仲間は菌類に多く存在し、多いもので はゲノム上に70種以上の遺伝子が存在します。ですが、リグノセルロース分解 で発現が誘導される遺伝子はその一部で、残る遺伝子産物が何を切ろうとして いるのかは分かっていません。また菌によって有するGH61のタイプも異なるよ うです。筆者は、このGH61の遺伝子群が特に植物病原菌や腐朽菌として知られ る菌類の個性を反映していて、その生理や生態と密接に関連しているのではな いかと感じています。個々の菌が有するGH61遺伝子のパターンや誘導のパター ンからその菌の生理・生態が（将来）理解できるかもしれません。 【CAZyのページ】 http://www.cazy.org/ ====================================================================== ６．お盆期間中のNBRC微生物株・DNAリソースの発送休止に関するお知らせ ====================================================================== NBRCでは下記のお盆期間中、送付後の微生物の品質を確保するため、微生物 株・DNAリソースの発送を一時休止させていただきます。 発送休止期間：平成25年8月6日（火）～16日（金） 上記発送休止期間中にお急ぎでご利用になりたい場合は、電話（0438-20- 5763）にてご相談ください。また、発送以外のご依頼・お問合せ等につきまし ては、通常通り対応させていただいております。ご利用の皆様には、ご不便を お掛けいたしますが、何卒ご了承いただきますようお願い申し上げます。 【生物遺伝資源の提供・寄託について】 https://www.nite.go.jp/nbrc/cultures/index.html ====================================================================== ７．NITEフレンドシップデイの開催のお知らせ ====================================================================== NITEが日頃行っている活動を多くの方々に知っていただくため、一般公開を 行います。NITEの業務が暮らしのどの部分に関わっているのか、パネル展示や 各種体験を通じてご紹介します。皆様のお越しを心よりお待ちしております。 日程：平成25年 8月18日（日）10：00～17：00 場所：独立行政法人製品評価技術基盤機構 本所 東京都渋谷区西原2－49－10 https://www.nite.go.jp/gen/osirase/friendship/2013.html ====================================================================== ８．NITEバイオテクノロジーセンター展示のお知らせ ====================================================================== 以下に出展いたします。お立ち寄りいただいた皆様からのご相談やご質問に もお答えします。是非お越しください。 2013年度（第28回）日本放線菌学会大会 日程：2013年9月5日（木）～6日（金） 場所：メルパルク広島（広島市中区基町6-36） http://home.hiroshima-u.ac.jp/saj2013/ 日本防菌防黴学会 第40回年次大会 日程：2013年9月10日（火）～11日（水） 場所：千里ライフサイエンスセンター（大阪府豊中市新千里東町1-4-2） http://saaaj.jp/conference/index.html/ 第65回日本生物工学会大会 日程：2013年9月18日（水）～20日（金） 場所：広島国際会議場（広島市中区中島町1－5) http://www.sbj.or.jp/2013/ BioJapan2013 日程：2013年10月9日（水）～11日（金） 場所：パシフィコ横浜（横浜市西区みなとみらい1-1-1） http://www.ics-expo.jp/biojapan/main/index.html ====================================================================== 編集後記 ====================================================================== ここNBRCのある木更津地域では、梅雨らしい雨模様になることも少なく、梅 雨が明けてしまいました。梅雨明け以降は、連日酷暑がつづきメタボ予備軍の 私には辛い季節がやってきました。今夏予報は、猛暑とのことで、こまめな水 分補給や適度な塩分補給などで、熱中症にならないよう乗り切りたいものです ね。ただ、汗をかいた暑い日はカロリーの高い飲み物が恋しくなります。予備 軍の私には糖分の取りすぎにも注意が必要なようです。(JS) ◆◇◆ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ◆◇◆ ・受信アドレス変更、受信停止は以下のサイトからお手続き下さい。 https://www.nite.go.jp/nbrc/cultures/others/nbrcnews/nbrcnews.html ・NBRCニュースは配信登録いただいたメールアドレスにお送りしております。 万が一間違えて配信されておりましたら、お手数ですが、下記のアドレスに ご連絡ください。 ・ご質問、転載のご要望など、NBRCニュースについてのお問い合わせは、下記 のアドレスにご連絡ください。 ・掲載内容は予告なく変更することがございます。掲載内容を許可なく複製・ 転載されることを禁止します。 ・偶数月の1日（休日の場合はその前後）に配信します。第23号は10月1日に配 信予定です。 編集・発行 独立行政法人製品評価技術基盤機構（NITE）バイオテクノロジーセンター NBRCニュース編集局（[email protected]） ◆◇◆ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ◆◇◆
